La cromatografía líquida/espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS) es el método de referencia para toxinas lipofílicas desde julio del 2011. De acuerdo al Reglamento Europeo EU 25/2011 este método debe utilizarse de forma habitual para los controles oficiales en cualquier etapa de la cadena alimentaria y para los autocontroles de los operadores de empresas alimentarias. Esta legislación se aplica en Europa y cualquier otro país que exporte moluscos bivalvos a la Unión Europea.
El ensayo biológico en ratón requiere de formación básica de manejo animal y laboratorio, es por ello que ha sido ampliamente usado para determinar toxinas diarréicas en laboratorios experimentados o pequeños productores durante muchos años. Sin embargo, la implantación del método líquido masas es un tanto compleja y puede ser difícil de conseguir. La elevada inversión en equipamiento y personal que requiere esta metodología puede llevar a que pequeños o medianos productores tengan que subcontratar estos análisis, y que laboratorios privados, que hasta ahora usaban el método biológico, dejen de ofrecer este servicio analítico.
Productores o procesadores de moluscos bivalvos, laboratorios oficiales o privados que estén haciendo análisis de toxinas lipofílicas deberán de cambiar de metodología antes del 1 de enero del 2015. Laboratorios de referencia de los principales países productores como España, Francia, UK o Italia acreditaron esta metodología mucho tiempo antes de la fecha de implementación. Sin embargo, todavía hay usuarios que utilizarán el ratón hasta los últimos días.
Cuando la legislación fue aprobada en julio del 2011, algunos líderes de opinión mostraron preocupación sobre la capacidad del método LC-MS validado para proteger a los consumidores (Otero et al, Analytical Chemistry 2011). El efecto de factores no controlados en el método, junto con la falta de información sobre toxicidad hizo creer que esta decisión se tomo de modo apresurado. Aunque estas conclusiones no fueron compartidas por otros expertos, la controversia aún hoy esta abierta. Además, España solicitó a la Comisión Europea una ampliación para la implantación del nuevo método. Así pues, aún hoy hay laboratorios dentro y fuera de la Unión Europea, que están indecisos, tienen aún un largo camino por recorrer o buscan otras alternativas.
La legislación Europea (2074/2005 y 15/2011) también permite el uso de otros métodos analíticos para la monitorización de toxinas lipofílicas, siempre y cuando cumplan los criterios de eficacia establecidos por el LR-UE (laboratorio de referencia Europeo) y proporcionen el mismo grado de protección para la salud pública. Actualmente existen otros dos métodos que cumplen con estos requisitos, un ensayo de inhibición de fosfatasa-PPIA- (Smienk et al, Toxins 2012) y un LC-MS/MS (Van den Top et al, Food & Contaminants 2011).
El ensayo de inhibición de fosfatasa- OkaTest- es el único test comercial validado en ensayos inter e intra-laboratorio; y tal y como expone el LR-UE cumple los requisitos del reglamento (EC) 2074/2005 y puede ser usado para la detección de toxinas del grupo del ácido okadaico (OA, DTX1, DTX2, DTX3 incluyendo sus esteres).
OkaTest: método colorimétrico de inhibición de la fosfatasa
Productores o procesadores de moluscos y analistas pueden fácilmente implantar el kit OkaTest en sus laboratorios, ya que sólo necesitan una experiencia básica en laboratorio y un equipamiento mínimo no específico. El kit permite obtener resultados en unas horas y por tanto tomar decisiones más rápidas en cuanto a extracción o procesado del producto. El uso de este kit para autocontrol, antes de la extracción en bateas próximas a una zona cerrada o en áreas con niveles de toxinas por debajo del límite legal, puede evitar pérdidas económicas importantes. OkaTest puede ser especialmente útil en áreas donde son habituales los bloom de toxinas de ácido okadaico.
Para una completa monitorización de toxinas lipofílicas OkaTest deber de complementarse con otros métodos que detecten yessotoxinas (YTX), pectenotoxinas (PTX) y azaspirazidos (AZA).
La combinación de OkaTest y LC-MS/MS puede ser un buen sistema para monitorizar las toxinas lipofílicas en moluscos bivalvos.
OkaTest y LC-MS/MS son herramientas analíticas fiables cuyas ventajas pueden combinarse proporcionando importantes beneficios a sus usuarios. LC-MS/MS es capaz de identificar toxinas de varios grupos individualmente, aunque necesita de personal especializado y una gran inversión en equipamiento. OkaTest detecta la toxicidad potencial de la muestra, cuantificando toxinas de ácido okadaico por inhibición de fosfatasas, y no requiere personal cualificado ni equipos específicos. Laboratorios con elevado número de muestras o acceso limitado a equipos de LC-MS pueden beneficiarse de la combinación de ambas metodologías en el análisis de rutina, ya que el coste del ensayo por muestra y el tiempo hasta la obtención de resultados es considerablemente menor.
Para la determinación de toxinas lipofílicas por LC-MS/MS hay que hacer 2 inyecciones por muestra; una de ellas para determinar YTXs, AZAs, AO libre y PTXs, y una segunda para los derivados del ácido okadaico. Esta segunda inyección puede derivarse a OkaTest, ya que este kit permite cuantificar el total de las toxinas del grupo del ácido okadaico en más de 43 muestras en un mismo día. Sin embargo, se necesitan hasta 20 horas para analizar 25 muestras con LC-MS/MS y por tanto los resultados no se pueden presentar hasta el día siguiente (Blanco et al, Revista Galega dos Recursos Mariños 2013).
La combinación de ambas metodologías puede también usarse en casos de bloom de toxinas del grupo del ácido okadaico han sido previamente identificados por LC-MS/MS. Ante un caso de bloom, el número de muestras y frecuencia de las mismas aumenta. OkaTest se puede usar para analizar esas muestras y para hacer un seguimiento del bloom hasta la apertura de la zona ala extracción.
